在室温或在4°C恒湿机内完成孵育。每一步骤完成后请将试剂汲除, 但是避免在每一步骤的过程中间让试样变亁。

请使用足量的试剂覆盖试样(通常为20到50 mL)。

使用10%正常山羊血清(Normal Goat Serum, Calbiochem目录编号NS02L)孵育20分钟以抑制免疫球蛋白的非特定结合现象。

在PBS中进行清洗, 更换3次且每次进行15分钟。

在室温条件下或者在4°C条件下(隔夜进行), 使用含有1% BSA的PBS溶液孵育初级抗体60分钟。福马林固定和石腊包埋切片建议使用隔夜孵育的方法。特定应用的最佳抗体浓度应使用低定法测定; 起始浓度在物质资料表中有给定。

在PBS中进行润洗, 更换3次且每次进行5分钟。

在PBS溶液中使用和合适生物素複合的第二步骤抗体孵育45分钟。特定应用的最佳抗体浓度应使用低定法测定; 起始浓度在物质资料表中有给定。

在PBS中进行润洗, 更换3次且每次进行5分钟。

在含有卵白素辣根过氧化酶 (目录编号 OR03L)的PBS溶液中孵育15分钟。特定应用的卵白素複合体浓度应使用滴定法测定; 建议起始浓度在物质资料表中有给定。

使用PBS溶液广泛清洗。

在 TRITON®-PBS溶液中润洗30秒。

在DAB溶液中孵育5分钟。然后使用显微镜监测。若需要进一步强化染色结果, 请重新置入DAB溶液中多孵育1到5分钟。

在蒸馏水中进行润洗。

若有需要请在苏木紫溶液中进行对比染色1到3分钟。

利用酒精和二甲苯去水合。

使用光学显微镜观察。